Präklinische Studien zum Wachstum des menschlichen Kolonkarzinom
RCD s.r.o.
Americká 632
252 29 Dobřichovice
DIČ: CZ47052511
WIRKUNG DES PRÄPARATS BIOCOL AUF DAS WACHSTUM DES MENSCHLICHEN KOLONKARZINOMS (LINIE HCT 116) BEI NU/NU MÄUSEN
Studienleiter: Doc. RNDr. Pavla Poučková, CSc.
Leiter des Experiments: RNDr. Marie Zadinová
Technische Zusammenarbeit: Eleonora Wenclová, Milena Altnerová, Olga Tachecí
Kontrolliert durch: Ing. Jiřina Polívková, CSc.
Den Bericht erstellte: Doc. RNDr. Pavla Poučková, CSc., RNDr. Marie Zadinová
Durchgeführt in RCD s.r.o. von 9.6.2005 bis 18.8.2005
WIRKUNG DES PRÄPARATS BIOCOL AUF DAS WACHSTUM DES MENSCHLICHEN KOLONKARZINOMS (LINIE HCT 116) BEI NU/NU MÄUSEN
- Studienziel:
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Antitumorwirkung des BIOCOL-Präparats auf das Wachstum des menschlichen Kolonkarzinom (Linie HCT 116) festzustellen, das subkutan (s.c.) in die Unterhaut von nu / nu-Mäusen transplantiert wurde.
2. Material und Methoden
2.1. Der getestete Stoff:
BIOCOL – der Stoff wurde in Form eines dunkelroten Pulvers geliefert. Es wurde nach der durch den Auftraggeber gelieferten Anleitung verdünnt. Die applizierte Lösung wurde unmittelbar vor jeder Anwendung vorbereitet, es wurde mit Trinkwasser verdünnt, täglich peroral (p.o.) in einer Dosis von 250 mg/kg, (5 mg/20g), im Volumen 0,2 ml/20g (10 ml/kg) Körpergewicht appliziert. Den Kontrollgruppen wurde täglich, p.o., das gleiche Volumen von Trinkwasser appliziert (0,2ml/20g, 10 ml/kg Körpergewicht).
2.2. Tumorlinien
Für den Versuch wurde die menschliche Tumorlinie des Kolonkarzinoms (HCT-116) verwendet, die primär von der Europäischen Tumorbank ECACC (European Collection of Cell Cultures, CAMR, Salisbary, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom) gewonnen wurde. In der Gewebekultur wurde diese Tumorlinie vermehrt und den nu/nu Mäusen wurde s.c. lxlO7 Tumorzelle zusammen mit 0,lml Matrigel – auf die rechte Seite der Maus appliziert.
2.3. Labortiere
Für den Versuch wurden die Outbreeding nu/nu Mäuse des Stamss CD-1, die Weibchen, mit einem Körpergewicht von 18 bis 20g, insgesamt 32 St., 16 Versuchs- und 16 Kontrollmäuse genutzt (Lieferant: AnLab s.r.o. Praha). Die Mäuse wurden in air laminal flow Boxen KAT- F/SZ-1000 (AnLab s.r.o.)gehalten, mit strahlensterilisierter Streu eingestreut (SAWI Research Bedding , AnLab s.r.o.Praha), mit strahlensterilisierter Diät ST-1 (AnLab s.r.o. Praha) gefüttert und mit autoklaviertem Wasser ad libitum getränkt.
2.4. Das eigene Verfahren
Am Tag vor dem Beginn der Einnahme des therapeutischen Stoffs BIOCOL (Tag 0) wurde 3 Mäusen Blut aus dem Augenplexus entnommen und es wurde das Ausgangsblutbild festgestellt. Vierundzwanzig Stunden nach der Entnahme wurde bei den nu/nu Mäusen CD-I die perorale Eingabe des Präparats BIOCOL für 10 Tage begonnen. (Den Versuchsmäusen wurde mit der Sonde 250 mg/kg BIOCOL appliziert.) Am 11. Tag wurden den nu/nu Mäusen s.c. die Tumorzellen auf die rechte Seite der Maus beimpft, und zwar mit einer Anzahl von 1x107/Maus. Nach der Beimpfung der Tumorzellen wurde die Therapie mit dem Präparat BIOCOL bei der Versuchsgruppe fortgesetzt. Die Kontrollmäuse haben für dieselbe Zeit mit der Sonde das gleiche Volumen von Trinkwasser bekommen. Der Versuch wurde am 36. Tag nach dem Beginn der peroralen Eingabe des Präparats BIOCOL beendet.
Versuchsgruppe:
P1 – 16 Outbreeding nu/nu Mäuse des Stamms CD-I, s.c. ca Kolonlinie HCT116 + p.o. 250 mg/kg BIOCOL.
Kontrollgruppe:
K1 – 16 Outbreeding nu/nu Mäuse des Stamms CD-I, s.c. ca Kolonlinie HCT 116 + p.o. Trinkwasser
Wachsende Tumoren wurden während des Versuchs0-jeden 3.-4. Tag gemessen und das Volumen des wachsenden Tumors wurde nach der Formel V= a x b2 x Jt/6 berechnet, wo a = Tumorlänge, b = Tumorbreite ist. Gleichzeitig wurden die Mäuse jeden 3. — 4. Tag gewogen. Der Versuch wurde am 36. Tag nach dem Therapiebeginn beendet.
2.5. Versuchsbewertung
Die Versuchsbewertung wurde aufgrund des Vergleichs der Tumorwachstumskurven in der Versuchsgruppe - im Vergleich zur Kontrollgruppe durchgeführt. Während des Versuchs und am Ende des Versuchs wurde % Inhibition des Tumorwachstums - %TGI (tumor growth inhibition), für das durchschnittliche Tumorvolumen, (%TGI = (1 -(durchschnittliches Tumorvolumen in der behandelnden Gruppe/durchschnittliches Tumorvolumen in der Kontrollgruppe)) x 100 berechnet. Die gewonnenen Ergebnisse wurden statistische durch den nicht parametrischen doppelseitigen Student-t-Test bewetet. Im Verlauf des Versuchs und am Ende des Versuchs wurde die Fotodokumentation der Wirksamkeit der Therapie im Vergleich zur Kontrollgruppe durchgeführt.
3. Ergebnisse und Diskussion
Die gewonnenen Ergebnisse sind in den Tabellen Nr. 1-11 und im Diagramm Nr. 1-9 angeführt.
Versuchsgruppe: 16 Outbreeding nu/nu Mäuse des Stamms CD-I, s.c. ca Kolonlinie HCT116 + p.o. 250 mg/kg BIOCOL
Kontrollgruppe: 16 Outbreeding nu/nu Mäuse des Stamms CD-I, s.c. ca Kolonlinie HCT 116 + Trinkwasser
Das Präparat BIOCOL hat nach der präventiven peroralen Eingabe 10 Tage vor der s.c. Applikation der Tumorzellen und nachfolgend als täglich auch nach der Applikation eingegeben – statistisch bedeutend die Zeit der Latenz des Wuchses des Kolonkarzinoms (HCT -116) bei den Versuchs-nu/nu-Mäusen durchschnittlich um 7,93 Tage auf 18,56 Tage (um 74%) auf 174,6% im Vergleich zur nicht behandelten Kontrollgruppe verlängert, wo das Wachstum des Tumors nach 10,63 Tagen (100%) (Tab. 1,2, Diagramme 1,2) festgestellt wurde.
Das Präparat BIOCOL hat teilweise den Wuchs des menschlichen Kolonkarzinoms, der Linie HCT-116 bei nu/nu Mäusen inhibiert. Die erreichte Inhibition war statistisch vom 18. bis 36. Tag des Versuchs bedeutend, und zwar auf 1% Ebene der Gewichtung. Der erreichte Prozentsatz der Inhibition des Tumorwuchses war im Vergleich zur Kontrollgruppe (%TGI) am 18. Versuchstag 64,4%, am 22. Versuchstag 56,1%, am 25. Versuchstag 53,8%, am 29. Versuchstag 47,04%, am 32. Versuchstag 39,53%, am 36. Versuchstag 31,61%. (Tab. 3,4,5,6,7 Diagramme 3,4,5,6)
Im Fall der Überwachung die Wirkung des Präparats BIOCOL auf das Gewicht der nu/nu Mäuse hat die Dosis von 250 mg/kg den Verlust des körperlichen Gewichtes der nu/nu Versuchsmäuse und nach der 5. Woche der Eingabe auch eine rosa-rote Verfärbung der Haut der nu/nu Mäuse verursacht. Der Verlust des körperlichen Gewichts der nu/nu Mäuse war statistisch bedeutend auf 1% der Ebene der Gewichtung vom 11. Tag bis 36. Tag der Therapie (Tab. 8,9,10,11 Diagramme 7,8,9)
Die Ergebnisse zeigen, dass das Präparat BIOCOL teilweise das Wachstum des menschlichen Kolonkarzinoms bei nu/nu Mäusen inhibiert hat, besonders günstig hat sich die Wirkung der präventiven Eingabe des Präparats vom ersten Versuchstag gezeigt – noch vor der Transplantation der Tumorzellen. Mit der steigenden Zeit der Eingabe des Präparats hat sich das % der erreichten Inhibition des Tumorwachstums allmählich verringert. Nach dem Aussehen der Mäuse setzen wir voraus, dass es zum Überdosieren des eingegebenen Präparats gekommen ist (siehe Foto).
4. Schlussfolgerung
- Die präventive Gabe des Präparats BIOCOL 10 Tag vor der s,c. Beimpfung der Tumorzellen (nachfolgend täglich auch nach der Applikation gegeben) hat statistisch bedeutend die Zeit der Latenz des s.c. Wachstums der Kolonlinie HCT-116 bei den nu/nu Versuchsmäusen im Vergleich zur Kontrollgruppe verlangsamt, und zwar um 74%. (um 7,93 Tage).
- Das Präparat BIOCOL hatte eine statistisch bedeutende Inhibitionswirkung auf das s.c. Wachstum des menschlichen Kolonkarzinoms der Linie HCT 116 bei den nu/nu Mäusen des Stamms CD-I. Am 18. Versuchstag wurde 64,4% Inhibition des Tumorwachstums im Vergleich zum Tumorwachstum der Kontrollgruppe erreicht.
- Mit zunehmender Zeit der Verabreichung des Präparats BIOCOL hat sich der Prozentsatz der erreichten Inbition des Tumorwachstums allmählich verringert, am 36. Tag wurde 31,61% Inhibition des Tumorwachstums im Vergleich zur Kontrollgruppe erreicht.
- Das Präparat BIOCOL hat in der verabreichten täglichen peroralen Dosis von 250 mg/kg statistisch bedeutend das körperliche Gewicht bei den Versuchsmäusen verringert.
Prag, den 15. 9. 2005
Doc. RNDr. Pavla Poučková, CSc.
